Az iPhone operációs rendszere az iOS (korábban iPhone OS), ez fut az iPhone-on,és az iPod Touch-on. Ugyanazon a Mach kernelen alapul mindkettő, ami a Mac OS X-ben is található. Az iOS tartalmazza a Mac OS X 10.5 verziójának "Core Animation" modulját, ami a PowerVR MBX 3D hardverrel együtt felelős a felhasználói interfészben található animációk akadásmentes lejátszásáért. Az operációs rendszer jóval kevesebb mint fél GB-ot foglal magának az eszköz háttértárából. Támogatja a később megjelenő alkalmazásokat.
Az iPhone-t az iTunes 7.3-as és későbbi verziójával lehet használni, ami kompatibilis a Mac OS X 10.4.10-es verziójával és a 32 bites Windows XP-vel és Vistával. Az iTunes 7.6-os kiadásában már támogatja mind a 64 bites Vista-t mind a 64 bites XP-t.
Az iPhone központi egysége egy ARM alapú processzor, ellentétben az Apple számítógépeiben használt x86-os illetve PowerPC processzorokkal. Ez azt jelenti, hogy az egyes alkalmazásokat nem lehet egyszerűen átmásolni a Mac OS X-ből, hanem újra kell írni és fordítani azokat az iPhone-ra. Emellett a Safari webböngésző támogatja a platformfüggetlen, AJAX-ban írt webes alkalmazásokat.
A főképernyőn iOS 7 esetén a következő alkalmazások találhatók alapból: Üzenetek, Naptár, Képek, Kamera, Videók, Térképek, Időjárás, Passbook, Jegyzetek, Emlékeztetők, Óra, Újságos, iTunes Store, App Store, Game Center, Beállítások és a FaceTime. Négy másik alkalmazás pedig még a képernyő alján, a Dock-on: Telefon, Mail, Safari és Zene.
A 2007-es WWDC-n, június 11-én az Apple bejelentette, hogy az iPhone támogatni fogja a külső alkalmazásokat is a Safari böngészőn keresztül, amely osztozik az iPhone interfészének kinézetével. 2007. október 17-én Steve Jobs egy nyílt levélben bejelentette, hogy 2008 februárjától elérhetővé teszik külső fejlesztők számára is az SDK-t (Szoftver Fejlesztői Környezet). A biztonsági aggodalmak miatt, illetve a Nokia digitális aláírási rendszerét követendő, várható volt, hogy az Apple hasonló rendszert fog alkalmazni. Az iPhone SDK-t hivatalosan 2008. március 6-án jelentették be az Apple Town Hall épületében. Az SDK segítségével a natív alkalmazások fejleszthetők az iPhone és iPod Touch-hoz és az iPadekhez, illetve tesztelhetők szimulátor segítségével. Az alkalmazás futtatása az eszközökön csak azután lehetséges, hogy kifizettük az Apple Developer Connection éves díját (99 dollár). A fejlesztők jóformán bármilyen árat szabhatnak az alkalmazásukhoz, amit az App Store-on keresztül terjeszthetnek és amiből 70% részesedést kapnak, 30%-ot pedig az Apple kap. A fejlesztők ugyanakkor választhatják azt is, hogy ingyenesen elérhetővé teszik az alkalmazásukat. Az SDK azonnal elérhető volt, miközben az alkalmazásokkal várni kellett a 2.0-s szoftverfrissítésig, amit 2008. július 11-én tettek közzé.
Az SDK megjelenéséig kizárólag webappok voltak elérhetőek az iPhone-ra, ami ezután nagyon rövid idő alatt megfordult, és az App Store lett az elsődleges. Az alkalmazások App Store-on kívüli telepítésének lehetőségét az Apple nem támogatja, hivatalosan azt csak a fejlesztők tehetik meg a saját készülékük esetén a saját, fejlesztés alatt álló alkalmazásukkal.
Az Apple ingyenes frissítéseket biztosít az iPhone operációs rendszeréhez az iTunes-on keresztül, az iPod-okéhoz hasonló módon. Biztonsági javításokat, illetve új, javított funkciókat is ilyen módon adnak ki. Ez alól az első kivétel az iPhone eredeti (2G) kiadása volt, amelynek támogatását az Apple 2010 áprilisát követően, az iOS 3.1.3 megjelenése után megszüntette.[6] Később az iPhone 3G támogatása is megszűnt, arra az iOS 4.2.1-es verziója után nem érkezett több frissítés. Őket a 3GS követte a 6.1.6-al, egyúttal az iOS megújulását jelentő iOS 7-ből így kizárva.
Az Apple által kiadott ingyenes szoftverfrissítéseket az iOS 5.0.1-ig az iTunes segítségével lehetett telepíteni, majd az 5.0-ban bemutatkozó OTA (over-the-air) opciónak köszönhetően ezt már akár közvetlenül a készüléken is megtehetjük a Beállítások appon belül. Az első OTA frissítés az 5.0.1 volt. Az új szoftververziók legtöbbször új iTunes-verziót is igényelnek az iOS-ben megjelenő egyes új funkciók miatt. Így például az iOS 3.0-hoz iTunes 8.2 kellett, a 3.1-hez iTunes 9.0, az iOS 4.0-hoz iTunes 9.2. Az iOS 5-höz már az iTunes 10.5 volt szükséges, viszont ennek követelménye Mac esetén Mac OS X 10.5.8 vagy Leopard a legalább 800 MHz-es G4-es vagy G5-ös rendszereken, így az iOS 5-ös vagy újabb készülékek nem szinkronizálhatóak az iTunes segítségével a Mac OS X korábbi verzióin.